检测磷酸化蛋白的小技巧
2023-05-18 23:00:13
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Western blot检测磷酸化蛋白是研究信号通路的重要手段，然而，检测磷酸化蛋白常常不是那么容易。这里向大家介绍一些检测磷酸化蛋白的小技巧，希望对大家的实验有所帮助。
● 一定要在Lysis Buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。（磷酸酶抑制剂中，钒酸钠（Na3VO4）的使用浓度为1mM，氟化钠（NaF）的使用浓度为1mM）
● 加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间，因为磷酸化的蛋白只占总蛋白量的极少部分；二抗则室温1小时即可。
● 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。
● 抗体的稀释倍数要优化，可以根据厂商建议进行优化。
● 用含5% BSA的TBST稀释抗体。
● 磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅.。
● 磷酸化蛋白WB时，用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗5min3次即可，宁愿背景深一些,总比做不出来强得多。另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。
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本文来源：细胞之邦
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