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关于乳腺生物反应器,那些目标蛋白的纯化(二)

中科森辉微球 2019-05-16 06:43:24

参考文献:乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白的分离纯化及生物活性鉴定

作者:白倩,张焱,汪音爵,罗坚,李岩,黄永东,马润宇,苏志国



这周的系列的文章都是基于乳腺生物反应器的目标蛋白的纯化工作,关于乳腺生物反应器,可以戳这里 母乳喂养周,不如谈谈乳腺生物反应器吧




母乳喂养周设立的初衷是希望全社会都积极鼓励和支持母乳喂养,尤其是在中国,国人在母乳喂养方面曾经走过一段时间弯路,比如觉得奶粉或牛乳比母乳更有营养而采用奶粉喂养(一大堆八零后哭晕在厕所)。


而实际上,且不说母乳中含有很多抗体等免疫因子,在矿物质和蛋白成分组成方面也有很大不同。以乳铁蛋白rHLF为例,人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml,是牛乳中的10倍。所以用牛乳代替母乳,乳铁蛋白的含量是远远不达标的。




母乳喂养的初衷是好的,但总有些情况导致母乳喂养不能实现,所以向母乳代用品中添加乳铁蛋白等、减低矿物质等的含量,也不失为一种好的选择。而且近期的研究发现,乳铁蛋白不仅参与铁的转运,而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能,被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。



极其广阔的市场前景,吸引了多家国际原料供应商投入巨资进行大规模的商业化生产。随着转基因技术的突飞猛进,利用 家畜乳腺生物反应器大规模生产人乳铁蛋白已经获 得成功,从重组牛乳中纯化所得的 rHLF 蛋白可以 广泛应用于医药及营养等领域。


什么是乳铁蛋白


乳铁蛋白 (Lactoferrin,LF) 又名乳转铁蛋白, 是转铁蛋白家族的重要一员。其分子量大约 80 kDa[1], 等电点为 8.7 左右[2]。乳铁蛋白分子中结合了两条糖 链,占分子量的 7%左右。蛋白分子 N 端和 C 端的 特征环状结构可以结合三价铁离子。乳铁蛋白具有 多种重要的生理功能,主要包括铁吸收与释放、抗 菌活性以及炎症反应中的铁离子代谢等。




纯化过程中引起失活



离子交换层析技术适用范围广,洗脱条件温和,已成为蛋白质分离纯化中非常重要的一种手段, rHLF 蛋白也可以通过阳离子交换层析进行有效纯化。

但是蛋白质在层析过程中存在的一个主要问题是介质表面可能引起蛋白质结构的变化,造成蛋 白质的失活。其中介质表面的配基类型和密度对蛋白结构影响大;而且在实际操作中所处理的物料为牛乳,其成分复杂对离子交换介质的污染比较严重,所以使用周期有限。因此合成价低质优的离子交换介质用于替代进口介质可以大幅度降低生产成本。




定制式层析介质解决失活问题



1.考察多个配基密度层析介质

鉴于rHLF 蛋白主要是通过阳离子交换层析进行有效纯化,团队制作了多个配基密度的层析介质,包括0.05, 0.10, 0.15, 0.20 and 0.24 mol/L并考察其静态吸附和动态吸附的性能,发现随着介质配基密度的增加,溶菌酶的穿透时间越来越晚,说明其动态载量越来越大;此外, 吸附曲线为窄陡型,说明自制介质具有很好的动态 吸附性能;其中高配基密度 (0.24 mol/L) 的介质穿透时间晚于其他对照介质,说明该高配基密度介质的吸附容量高具有良好的应用前景。







2.优化层析条件

影响离子交换层析的因素很多,包括层析介质、 流动相、pH 值、盐浓度、蛋白质浓度等,这些因素 之间的作用非常复杂。其中层析介质是纯化过程的核心,介质的性能对于分离的效果起到决定性的作用。


通过使用定制式的层析介质,结合摸索出的最优纯化条件,用高效凝胶过滤分析 (HPSEC, High-Performance Size-Exclusion Chromatography)分析结果表明,定制式介质纯化得到的重组人乳铁蛋白的纯度达到 95%以上,使用紫外积分计算回收率达到 80%以上。 纯化结果令人满意。






自制离子交换介质纯化rHLF 收集组分的SDS-PAGE

电泳分析图





以琼脂糖凝胶为基质的离子交换层析介质保留了天然多糖化合物极好的亲水性及孔结构,对生物活性大分子具有很好的相容性,特别适用于蛋白质、酶、多糖、核酸、质粒等的分离纯化。离子交换层析介质以高流速琼脂糖凝胶为基质,以-(CH2)2N(C2H5)2、-CH3N(CH3)3、-CH2COO-、-SO3-为配基,具有很好的化学和物理稳定性。

并且可提供客户的定制服务。




 证明产物是你想要的



为了评价定制式介质对牛乳腺表达的重组人乳铁蛋白结构的影响,我们使用圆二色谱比较了纯化产品和天然人乳铁蛋白的二级结构,结果表明不同配基密度介质洗脱下来的rHLF均与天然HLF 的圆二色谱曲线重合较好也想用圆二色?戳 伸手党福音!你可是要干大事的人 ),说明离子交换层析中介质配基密度的高低不会造成 rHLF 二级结构的不可逆变化,即我们定制式介质的纯化不会导致重组蛋白质的变性,有利于得到完整生物活性的重组蛋白。





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