【质谱小课堂第五期】关于差异蛋白质的一些问题讨论

【原创】今天要向大家介绍三个问题，均是在售后问题中常被提问，并在问题的答复上存有一定的争议。今天我们就将这些问题总结一下，并根据一些文献和实际实验的经验总结出答复，供各位参考。

—— 问题一：Label-free实验中，三次重复质谱实验数据中出现定量值为零的情况，应该肿么办？

Label-free实验中由于不用标记试剂，不用将多组样本混合上机，这样会降低对样本量的损耗，且比较适合差异较大的样本进行差异蛋白质组学分析，甚至可以用于比较不同种属类的样本。当遇到样本量比较珍贵且要获得所谓“有无”差异蛋白质的情况时，往往也会被建议使用该技术。

小编回复：质谱分析的特点是若同一个样品进行多次重复质谱分析，每次质谱鉴定的结果都不会完全相同（overlap的数据约70%）。只要有一次质谱结果鉴定到某蛋白质，就说明样品中存在该蛋白质。但是为了后续统计分析的需要，一般标准是选取三次质谱重复实验中至少在两次质谱中鉴定到的（即有定量值的数据，且定量值不为零），取平均值；如果只在一次实验中有值，则不采用该数据进行定量分析。当一个样本组中某蛋白质在三次定量结果中均无值（或者显示为“0”），而该蛋白质在另外一个实验组中至少有两次以上定量值不为“0”时，可认为此差异为“有无”表达差异。但是对于质谱结果中“有无”差异的结论一定要慎下，需要其他实验方法的进一步验证。

—— 问题二：差异蛋白质数量较少的原因是什么？

有一些客户会在拿到iTRAQ或者label-free或者其他同等的差异蛋白质组学分析结果时，抱怨我的差异蛋白数量怎么这么少？天了噜，其实我也很想知道的！差异蛋白质的数目主要跟两方面有关，一个是前期的实验技术，另一方面就是后期的生信计算方法。我们先从后面这个聊起！

现在这类差异蛋白质组学技术（iTRAQ、label-free、SILAC、TMT等等）已趋于成熟，包括其中用于筛选差异蛋白质的生信计算方法都在很多文献中得到报道，是public的，并不是我们公司独一无二的算法。

如果后者无法作弊，那就是前面啦！前面的实验技术！亲，我很想说，当一个项目的蛋白质定性数量正常，而差异蛋白质数目比较少，这种情况好像、貌似不是一个实验可以作弊的吧！

同时，我们很想吐槽一下，您在抱怨差异蛋白质数目少的同时，竟然还有同学抱怨差异蛋白质数目太多，导致其无法往下看……无法往下……往下……   主子们，你们好难伺候啊，搞得我们头好大，好矛盾的！

小编回复：样本组别之间的差异蛋白质数量多少主要与样本本身的生物学差异大小有关。一般如正常组织和病理组织之间的样本差异比较显著，得到的差异蛋白质数量也较多（一般差异蛋白质数量占蛋白质鉴定总数的10%左右）。然而，病理组和药物处理组之间的样本差异则不一定显著，如药物是否有效、药物处理浓度是否合适、取样时间是否恰当等因素都可能导致差异蛋白质数量较少。

如果仅按照fold change>1.2（举例）筛选得到蛋白质数量并不少，但是通过p value <0.05再做进一步筛选后得到的差异蛋白质数量显著减少，则主要是由组内样本的生物学个体变异较大造成的。该情况下可考虑剔除组内样本重复检测数据中波动较大的个别数据。

—— 问题三：通过western blot检测到了样本中蛋白质或者蛋白质的磷酸化形式，为什么在iTRAQ或者磷酸化iTRAQ实验中没有检测到？

其实这个问题现在问的老师已经相对少了。在蛋白质组学刚刚普及的时候，这个问题可以列为top one。首先，质谱不是万能的，它也就是一个检测机器，也有它能力所不能及的地方，没有任何一位牛人说过质谱可以检测到样本当中所有的蛋白质。要不然现在人类蛋白质组也不会在苦苦追寻啦！

小编回复：western blot 检测是将目的蛋白质信号放大很多级之后进行检测的，灵敏度很高，（除非特异性结合之外）几乎不受复杂样品中背景蛋白质丰度的影响。对于纯蛋白质样品，质谱检测的灵敏度达fmol水平。但在复杂样品中，不同种类的蛋白质浓度动态范围较宽，而目前质谱检测的动态范围一般在3-4个数量级。样品中丰度较高的蛋白质优先、多次被检测到，而丰度较低的蛋白质则因为肽段信号过弱被淹没而不能被检测到。因此，如果样品中待检测的目标蛋白质丰度较低（或者蛋白质分子量较小），即使WB能够检测到，质谱并不一定能检测到。

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