运动神经元病与TDP-43蛋白的病理性表达

4例运动神经元病患者均为解放军总医院1988年至2000年有详细临床病历及相关实验室检查资料的病例，曾长期住院，死后获得亲属同意及签署尸检同意书，进行了包括骨骼肌在内的全身尸检。

对4例尸检病例的常规组织学切片进行观察，包括额叶上回、、顶叶、颞叶、枕叶纹状皮质，扣带回、海马、基底节、丘脑，中脑上丘层面，桥脑蓝斑层面，延髓(舌下神经核)层面，脊髓颈6、胸7、腰4段水平，脊髓前、后神经根，舌肌、膈肌、股四头肌、三角肌的HE、LFB、Hozler等常规染色。

、海马、颞叶及延髓舌下神经核水平，脊髓颈6、胸7、腰4段水平石蜡组织切片，使用Anti-ubiquitin (Dako公司) 兔抗人多克隆抗体和Anti-phospho-TDP-43抗体(Ser409/Ser410, rat, clone 1D3，Millipore公司)进行免疫组化染色。采用EnVision二步法(ChemMate™ EnVision™试剂盒，Dako公司)，DAB显色。以相同年龄、无神经疾病病史、常规组织病理检查无异常发现的3例病例的脑和脊髓组织作为对照。

采用描述性方法进行统计学分析。

见表1。

4例患者的脑和脊髓组织学基本特征(图1)包括骨骼肌病理所见均符合运动神经元病的诊断标准，例3、例4脊髓前角神经元见特征性的Bunina小体(图2)。

图1-

例3颈髓(C₆)皮质脊髓前、侧索髓鞘变性(大体观)　监牢蓝髓鞘染色(LFB)

图2-

例3颈髓(C₆)神经元变性，胞质内见Bunina小体　HE×400

图3-

例1颈髓前角神经元丝团样包涵体　泛素免疫组化　×400

图4-

例2腰髓前角神经元圆形致密包涵体　泛素免疫组化　×400

图5-

例1颈髓前角神经元TDP-43卵圆形包涵体　磷酸化TDP-43免疫组化　×1 000

图6-

例1颈髓前角神经元及胶质细胞TDP-43阳性包涵体磷酸化TDP-43免疫组化　×1 000

图7-

例1运动皮质小型神经元及少突胶质细胞TDP-43阳性包涵体　磷酸化TDP-43免疫组化　×1 000

图8-

例2颈髓前角神经元胞质TDP-43阳性弥散型丝团样包涵体　磷酸化TDP-43免疫组化　×1 000

例1、例2、例4的脑干和脊髓残留的运动神经元胞质见泛素阳性包涵体结构，主要表现为丝团样结构(图3)、圆形致密或球形包涵体(图4)、路易样包涵体。磷酸化TDP-43(pTDP-43)蛋白免疫组化染色结果显示，例1、例2的脑和脊髓存在明确的pTDP-43蛋白表达，其中例1脊髓前角pTDP-43阳性神经元及胶质细胞包涵体形态特征如图5、图6所示，图7，例2脊髓前角神经元也发现pTDP-43阳性包涵体(图8)，例4脊髓前角神经元存在pTDP-43弱阳性表达，例3脑和脊髓组织pTDP-43表达阴性。对照病例无一例发现泛素阳性或pTDP-43阳性包涵体。

根据临床及病理组织学特征，运动神经元病通常分为ALS、原发性侧束变性以及进行性脊髓型肌萎缩，其中ALS最为常见，病程3～5年^[1]。我们报道的这4例尸检病例中，例1以球部症状发病，其余3例均表现为肢体运动症状起病；例4临床上仅表现为下运动神经元症状，缺乏锥体束征，其余3例表现有上、下运动神经元损害的临床特征；4例病例的肌电图均为典型的失神经元变性表现；3例患者生前使用过不同时间的呼吸机人工机械通气治疗。

4例患者包括骨骼肌在内的所有组织学改变均符合经典的运动神经元病病理所见^[1,11]。其中2例患者的脊髓前角神经元见到Bunina小体，较文献报告的Bunina小体阳性率稍低^[3,12,13]，这可能与下运动神经元变性程度较重有关。

蛋白质病理学已成为散发型运动神经元病病理机制研究的重要方向^[2,14,15]。在运动神经元病的蛋白质病理包涵体发现前，Bunina小体曾被认为是其较特征性的病理改变^[3,12]，进一步研究发现它主要表达晶状蛋白-C和转铁蛋白^[12,13]，并不表达泛素和TDP-43蛋白，形成机制尚不清楚。20世纪80年代末开始，不断有研究报道运动神经元病患者的脑和脊髓组织存在多种形态的泛素蛋白阳性神经元包涵体^[3,13]，它不仅具有形态上的特征性，而且其分布特征与运动神经元病的组织损害分布特征一致。

因此，泛素蛋白曾被认为是研究运动神经元病蛋白质病理机制的关键蛋白之一，长期受到关注，但与此同时，大量的临床神经病理研究发现其他一些神经变性疾病如帕金森病的路易小体、多系统萎缩的少突胶质细胞包涵体以及阿尔茨海默病的神经原纤维缠结及老年斑均不同程度表达泛素蛋白，因此认为泛素蛋白在神经变性疾病中的阳性表达缺乏疾病特异性。

自2006年Neumann等^[4]首次报道ALS和额颞叶变性(FTLD)患者的脑和脊髓组织存在病理性TDP-43表达以来，其他学者也相继对大量的解剖病例进行了深入研究^[5,6,16]，发现TDP-43蛋白病理性表达对包括ALS以及部分泛素阳性包涵体额颞叶痴呆在内的一组神经变性疾病具有特征性意义。

TDP-43是一种相对分子质量43 000的交互反应性DNA结合蛋白，具有多功能性，参与细胞内RNA转录、选择性剪接及mRNA稳定性调控等功能。病理性TDP-43蛋白是一种过磷酸化、泛素化分解产生的TDP-43 C-末端片段^[7]。我们对上述4例运动神经元病的脑和脊髓组织进行了pTDP-43及泛素免疫组化染色观察，发现例1、例2存在明确的TDP-43蛋白阳性表达，例4脊髓组织存在弱阳性表达。

征与神经元内泛素蛋白表达类似，与泛素蛋白表达不同的是还发现一定数量的胶质细胞TDP-43表达，，而在对照病例的脑和脊髓组织并未发现TDP-43阳性表达。因此，可以认为这种神经元及胶质细胞TDP-43蛋白的病理性表达对多数散发型运动神经元病具有特异性。

运动神经元病的TDP-43蛋白病理性表达的形态学及其分布具有特征性。正如Neumann等^[4]最早描述的那样，运动神经元病的下运动神经元内所有泛素阳性丝团样、圆形致密包涵体及路易样包涵体均呈现TDP-43阳性表达，同时TDP-43阳性包涵体也见于海马及额颞叶皮质。

Nishihira等^[5]和Geser等^[16]进一步对ALS的病理性TDP-43表达及分布特征进行观察，发现运动神经元病同时在脑和脊髓组织存在神经元和胶质细胞TDP-43病理性表达，其中以舌下神经核、脊髓前角、额叶运动皮质以及顶叶感觉皮质等部位阳性率最高，均为100%，此外还常常累及海马、纹状体、黑质以及小脑齿状核等广泛部位，因此，他们认为运动神经元病就TDP-43蛋白质病理而言，应该被称为多系统变性疾病。

由于我们报道的4例运动神经元病病例均为库存标本，组织标本选择部位有限，未能进行更为详细的观察。但对例1的额叶运动皮质、海马、颞叶及颈、胸脊髓的观察结果显示，除海马未观察到TDP-43阳性包涵体外，其余部位均观察到TDP-43阳性包涵体结构，而泛素阳性包涵体仅见于脊髓前角、舌下神经核，因此从此例的TDP-43蛋白表达情况看，支持运动神经元病属于中枢神经多系统变性疾病这种观点。

Mackenzie等^[6]研究发现所有散发性ALS、伴有痴呆以及SOD1阴性的家族性ALS患者的脑和脊髓组织均存在TDP-43阳性表达；而在SOD1阳性突变家族性ALS病例虽然存在泛素阳性包涵体，但TDP-43表达阴性，因此他们认为TDP-43蛋白可能在散发性ALS的病理机制中起重要作用。例3TDP-43表达阴性，但其发病年龄较晚，无家族史，该例由于库存组织不完整，因此未能进行更多部位免疫组化染色，不排除存在假阴性的可能。

病理性TDP-43蛋白除在散发性ALS表达外，还在部分泛素阳性、Tau阴性的额颞叶痴呆患者脑组织有特征性表达，因此目前有学者将这两种疾病又统称为"TDP-43蛋白质病(proteinopathies)"，推测二者可能为同一疾病谱之两种表型。有关运动神经元病和额颞叶痴呆的TDP-43蛋白病理性包涵体形成机制值得进一步深入研究^[17]。除了继续关注运动神经元病的TDP-43分子遗传学研究外，也应该重视其他分子如FUS、OPTN、UBQLN2和C9ORF72基因等突变的可能致病作用^[14,15]。