【技术文章】蛋白表达—酵母表达系统

1.     酵母表达系统简介

酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物对蛋白质的加工和修饰等功能。作为被研究的最多的真核生物，很早就被应用于异源蛋白的表达。与原核表达系统比较，酵母由于存在真核生物的蛋白修饰系统，易于表达出活性良好的蛋白；与其它真核表达系统如昆虫、动植物细胞等相比其具有快速、简便、成本低等优势。用作蛋白表达宿主酵母菌主要有酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 、多形汉逊酵母( Hansenula polymorpha) 、毕赤酵母( Pichia pastoris) 以及耶罗维亚酵母( Yarrowia lipolytica)等，其中以酿酒酵母和毕赤酵母的研究和应用最为广泛。 

2.     酿酒酵母表达系统

酿酒酵母是最早被用作酵母表达系统的宿主。1981 年 Hitzeman 等用它成功表达了人干扰素基因。酿酒酵母全基因组于 1996 年测序完成，更多的蛋白通过其成功表达。酿酒酵母中常用的表达载体是pYES(图1A)，在这个表达载体中，目的蛋白的表达受到半乳糖激酶启动子的控制，当有半乳糖存在时，宿主菌表达半乳糖激酶以分解半乳糖获得能量，同时启动半乳糖激酶启动子下游基因的转录，达到外源蛋白表达的目的。 近些年来，研究者们发现酿酒酵母存在难以高密度培养，缺乏强有力的启动子，分泌效率低，易存在过度糖基化等问题，因此寻找了新的酵母宿主—毕赤酵母。

3.     毕赤酵母表达系统

，也是应用最广泛的真核表达系统，目前已有500多种外源蛋白在该表达系统中获得表达。在毕赤酵母表达系统中，常用的表达载体主要有诱导型表达载体和组成型表达两种。组成型表达载体pGAPZ(图1B)以3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子为外源蛋白表达启动子，不需要诱导。而诱导型表达载体pPIC9k(图1C)和pPICZα (见图1D) 以醇氧化酶基因( Alcohol Oxidase，AOX)启动子启动外源基因的表达，只有在甲醇存在的情况下外源基因才能开始转录。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一种，可以在含有甲醇的培养基上快速生长。当 P. pastoris 在培养基上以甲醇为唯一碳源和能源生长时，甲醇就可作为醇氧化酶的诱导剂，严格调控外源基因的表达，而葡萄糖和甘油则是乙醇氧化酶基因启动子调控途径的抑制剂，不利于外源蛋白的表达。根据利用甲醇能力的不同，可以将毕赤酵母宿主菌分为3种类型，其代表GS115、KM71和 MC100-3均为甲醇诱导型。在以甲醇为唯一碳源时，强烈诱导启动子使外源蛋白大量表达，其区别在于AOX1或AOX2基因的缺失会造成对甲醇的利用能力不同。应用最广泛的宿主菌为GS115，其具有完整的AOX1和AOX2基因，在含有甲醇的培养基上生长迅速，其表型为Mut +； 宿主菌KM71的AOX1基因被敲除，因此利用甲醇的能力降低，为甲醇利用缓慢型，其表型为Muts； MC100-3 菌株的 AOX1和AOX2基因均被敲除，因此不利用甲醇，其表型为Mut-。

对于胞内表达的蛋白，优先考虑用Muts表型，而Mut+更利于分泌表达，Mut+较之Muts利用甲醇要快，对于提高外源蛋白的表达量更为有效；一般首选胞外分泌型而又易于操作的穿梭载体进行表达，因为胞内分泌蛋白不利于目的 蛋白的下游纯化工作，尤其是大规模发酵生产目的蛋白时，使用分泌型表达载体更有利于生产应用；为了避免分泌型表达的外源蛋白被酵母自身分泌的蛋白酶所降解，还可以选蛋白酶缺失型菌株，如SMD1163、SMD1165和SMD1168，该类菌株为高效表达外源蛋白提供了一个稳定的环境，有广泛的应用价值。例如 Guo等将来自黑曲霉 ( Aspergillus niger) Z-25 的葡萄糖氧化酶，在毕赤酵母蛋白酶缺陷型菌株SMD1168中成功表达；Tojo等也用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168成功表达了人纤维蛋白素原；而Sarkar等利用SMD1163菌株成功表达了G-蛋白偶联受体。基于甲醇酵母基因表达系统的优点，近年来得到了广泛的重视。

图1酵母表达系统常用载体图谱

4.     结语

酵母既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和操作过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备了典型的真核生物表达体系的特点。而且由于酵母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中总蛋白的绝大多数，这大大降低了蛋白质分纯的难度。虽然许多外源蛋白都可以在酵母中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表达量千差万别，外源蛋白的表达受多方面因素的影响，对这些影响因素进行综合分析，在现有表达条件的基础上做进一步的优化改进，从而不断提高外源蛋白的表达量，以适应生产实际应用。