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蛋白质不表达:常见原因及分析

中国病毒学论坛 2018-11-08 12:27:36



做蛋白表达实验的时候,有时候实验会觉得参考实验方法和克隆的蛋白基因序列完全没有问题,蛋白电泳就是没有结果。就个人经验总结和一些网络资源汇总了下蛋白不表达的原因。


1.载体构建错误。 这个屡见不鲜,很多克隆新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体,其克隆位点常有一两个碱基的区别;另外有些酶产生粘端有些酶产生平端,这些都容易导致读码框错误,从而表达不出来。




2.宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体,或者特殊用途的载体,或者有特殊启动子的载体,必须选择合适的宿主菌进行表达。因此,当你的蛋白没有表达出来时,可以考虑更换宿主菌。见下图

3.密码子的使用频率低。有些基因其本身含有许多稀有密码子,尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子,对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好,对真核表达系统未见得有很好的效果。曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果,试图将密码子优化进行表达,结果还是没有表达。一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体,表达量居然出奇地高!这是一个辛酸的笑话,但是一个真实的故事。

4、质粒不稳定或者质粒丢失。pET系统通常比较稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时,也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素,使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白,对宿主细胞也有毒性,造成质粒丢失。这种情况多见于真核表达系统。

5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸时,容易遭受蛋白酶降解,此即N-末端规则。N-端是Met时,大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走,特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时,也容易导致蛋白被降解。C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的,则不易被降解。

6、二级翻译起始位点。这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。那就怪不得人家了,核糖体会很高兴地找到这个位点,然后开始翻译,致使你的蛋白被截短,在电泳时看不到预期大小的片段。

7、SD序列。 这个不陌生吧?考研时老师喜欢出名词解释,也难怪人家老是拿这个出题----SD序列和起始密码子序列(80%是AUG,也有GUG的)之间的距离,对蛋白表达的效率也有着非常重要的影响。SD序列本身的组成对翻译效率也有影响。有时为了减少包涵体的产生,还特别对SD序列进行修饰呢!

8、mRNA的二级结构。在克隆之前,你得看看你的序列里是否有和核糖体结合位点和/或翻译起始位点互补的序列。如然,你最好进行同义密码子替换。否则由此形成的mRNA二级结构,会让翻译嘎然而止的。

9、意外终止。这种情况见于PCR扩增序列时,会和你开个不大不小的玩笑。比如它会将序列中间TAC突变为TAA,让你的蛋白翻译刹车。所以在进行表达之前,一定要进行测序,避免这种情况的发生。

10、转录终止子。转录终止子的存在可以促进蛋白表达;但是缺少时就会造成“通读”,没完没了地读下去。这在pET系统里不成问题,因为它在靶基因的相反方向有个选择性的标记基因。如果你的靶基因正好和这个标记基因方向一致,那么你得看看你的靶基因后是否有个转录终止子。如果没有的话,它们会竞争得天昏地暗,抢着生成mRNA和蛋白质。

11、mRNA的不稳定性。 靶基因的mRNA常聚集于细胞内。但是大肠菌的mRNA及其不稳定。如果在mRNA的5'-非翻译区和3‘-rho非依赖性终止子处插入稳定结构序列,可以促进mRNA的稳定性。尤其是5'末端要是有个不带突出的发夹结构,能让mRNA在胞浆内无生命之虞。

12、检测方法的可行性。有时候,蛋白的确表达了,只是表达量特别低,或者和杂带靠得特别近,致使你错误地以为蛋白没有表达。这时候,你可千万别忘记了生物学实验的两大黄金准则:对照和重复。说到对照,有很多层意思。最基本的意思是,要设立空载体对照。在真核系统表达的蛋白,常常量特别低。因此你不要老是想着WB和SDS-PAGE去检测。这时候,你必须另辟蹊径,找找看这个蛋白有米有很特别的性质。如果它具有酶活性,那简直就是便宜你了。还比如说,某些蛋白具有异样性质,比如说流感病毒的HA,你拿表达的不同梯度稀释的蛋白做个血凝。如果发生血凝,并且呈现一定的梯度关系,那简直就是板上钉钉的事情了。

总结起来,套用一句很经典的电影台词:能表达出来的蛋白,其原因都是一致的;表达不出来的蛋白,各有各的原因。我这个小帖子,就是给你一点启示:从哪里找原因。希望能抛砖引玉,得到更多有价值的建议。

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来源:网络

本期编辑:Tony