手工免疫组化检测非小细胞肺癌ALK蛋白表达的对比研究

摘要：目的 探讨不同克隆ALK抗体手工免疫组化方法(IHC)检测间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合非小细胞肺癌(NSCLC)中ALK蛋白表达情况。方法 选取60例NSCLC石蜡样本，运用4种抗体D5F3(Ventana)、D5F3(Cell Signaling)、1A4/1H7(OriGene)、5A4(Abcam)联合常规手工IHC分别检测NSCLC的ALK蛋白水平，与抗体D5F3(Ventana)采用全自动免疫组化染色(BenchMark)结果进行对比分析。结果 D5F3(Ventana + BenchMark)检测发现32例ALK融合阳性NSCLC，28例融合阴性NSCLC，经FISH验证结果一致。采用手工IHC方法，4种抗体D5F3(Ventana)、D5F3(CellSignaling)、1A4/1H7、5A4染色灵敏性分别为93.8%、84.4%、93.8%、56.3%，特异性均100%，与D5F3（Ventana + BenchMark）染色结果的一致性分别为96.7%、91.7%、96.7%、76.7%。手术切除大标本的ALK阳性表达优于活检小标本。结论 手工IHC方法简便经济、易于普及，选择高灵敏性特异性抗体，可以用于中小医院临床筛查ALK融合NSCLC，染色阳性病例再进行抗体D5F3(Ventana)全自动免疫组化染色或FISH检测。

关键词：肺；非小细胞癌；间变性淋巴瘤激酶；免疫组化；筛查

Screening of anaplastic lymphomakinase rearrangement associated non-small cell lung cancer by manualimmunostainer detection with multiple ALK antibodies

Shen Qin,Wang Xuan, Yu Bo, Liu Biao, Xu Yan, Wang Yanfen, Xia Qiuyuan, Zhou Xiaojun(Department of Pathology, JinlingHospital, Southern Medical University, Nanjing 210002, China)

Abstract: Purpose To explore the immunohistochemical expression in anaplastie lymphoma kinase (ALK) gene fusionnon-small cell lung cancer (NSCLC) by different ALKantibodies with manual immunostainer detection system. Methods Sixty NSCLCs weredetected by IHC including autostainer (D5F3,Ventana + BenchMark) andmanual staining using four different antibodies of D5F3 (Ventana), D5F3 (Cell Signaling), 1A4/1H7 and 5A4. All cases were verified with ALK FISH. Their expressions by manual staining with four antibodies were compared with those by D5F3 (Ventana + BenchMark). Results Thirty-two ALK gene rearrangement NSCLCs and twenty-eight negative cases wereidentified by FISH and D5F3 (Ventana+ BenchMark). The sensitivity ofdifferent antibodies eachwas 93.8%, 84.4%, 93.8%, 56.3%, and all the speciticitywere 100%. The consistency with D5F3(Ventana + BenchMark) was 96.7%, 91.7%, 96.7% and 76.7%, respectively. Thevalidity of immunohistochemical staining in surgical resection specimens wasbetter than in small biopsies. Conclusion Effectiveroutine manual immunohistochemistry with high-affinityantibody clone may provide a more economic and widespread pre-screeningtechnique for ALK gene fusionNSCLC.

KeyWords: Lung; Non-small cell cancer; ALK; Immunohistochemistry;Screening

非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer, NSCLC)是肺癌最常见的类型，约占85%，5年生存率仅15%^{[1, 2]}。近年新发现间变性淋巴瘤激酶(anaplastielymphoma kinase, ALK)基因融合性NSCLC对ALK激酶抑制剂克唑替尼(Crizotinib)高度敏感，检测ALK状态以便筛选出适合靶向治疗的患者是关键所在，是临床及病理医生的共同任务。目前推荐检测方法包括荧光原位杂交(FISH)、序列特异性PCR技术(RT-PCR)和全自动免疫组化^[3]，这些检测方法都需要严格的技术操作和昂贵的仪器设备，目前在中国三等甲级医院已经规范实施，但在更多的中小基层医院，由于受到实验条件、样本质量、患者经济以及大型设备等因素的限制而无法广泛开展。本实验运用手工IHC染色、全自动IHC染色检测NSCLC的ALK蛋白状态，对比全自动IHC的结果，分析多种不同ALK抗体手工染色表达情况，试图选出一种更易在中小医院普及的筛查方法。

1 材料与方法

1.1 临床材料 收集南京军区南京总医院2013年期间经病理确诊的60例非连续性NSCLC标本，包括活检小标本(经皮肺穿刺、纤支镜活检)及手术切除大标本(肺叶切除、转移病灶切除)的石蜡包埋组织。临床资料由管床医师及病案室提供。

1.2 标本处理 标本经10%福尔马林固定，常规标准自动脱水，石蜡包埋，切片厚约4um，以备HE染色、IHC染色和FISH检测。

1.3 免疫组织化学染色(IHC) ⑴抗ALK(D5F3)兔单克隆抗体(D5F3,Ventana,Tucson,AZ)运用Ventana全自动免疫组化染色设备(BenchMark,Ventana,Tucson,AZ)及Ventana OptiView信号扩增试剂盒检测ALK蛋白表达，每批检测均有阳性阴性对照试验。结果判读采用二分类系统，即阳性和阴性两种。不论比例的肿瘤细胞浆出现棕黄色颗粒，即诊断为ALK阳性。⑵即用型抗ALK(D5F3)兔单克隆抗体(D5F3,Ventana,Tucson,AZ)，抗ALK(D5F3)兔单克隆抗体(D5F3,CellSignaling Technology,Billerica,MA)、1：100稀释，即用型鼠抗人抗体ALK(1A4/1H7,OriGene,USA)，鼠抗人ALK抗体(5A4,Abcam,UK)、1：50稀释，均采用EnVision(Dako)手工IHC染色。参考手工IHC的评判标准^[4]：3+，＞75%的肿瘤细胞胞浆弥漫棕黄色颗粒状着色；2+，＞50%的肿瘤细胞胞浆黄色至棕色颗粒状；1+染色强度及范围弱于2+；0，完全不着色。经3位病理医师分别进行评判。

1.4 荧光原位杂交(FISH) 使用双色分离探针(Vysis LSI ALK；Abbott Molecular, Abbott Park, IL)，ALK基因的3’和5’分别标记红色和绿色荧光信号。操作步骤参见说明书，所有肿瘤样本先经HE染色定位癌区，在荧光显微镜下观察100个肿瘤细胞。ALK野生型则呈现红绿色融合(黄色)信号；若＞15%肿瘤细胞ALK位点表现以下信号时判读为ALK重排阳性：⑴融合黄色信号+1个红色信号+1个绿色信号，红绿间距超过2倍信号点宽度；⑵融合黄色信号+1个单独红色信号^[4,5]。

2 结果

2.1 临床特征 60例NSCLC，男性38例，女性20例，平均年龄54.3岁(30-82岁)。不吸烟或少量吸烟42例，多量吸烟18例。Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期38例。肿瘤平均大小95px(0.9-300px)。肺部原发病灶活检小标本16例，肺部原发病灶切除大标本40例，转移病灶切除标本4例(右锁骨淋巴结2例、额叶1例、顶叶1例)。患者肿瘤活检或切除之前均未接受化疗或放疗。

2.2 D5F3(Ventana + BenchMark)染色阳性表达结果 32例D5F3(Ventana+ BenchMark)染色阳性表达，28例染色阴性，所有样本均FISH检测验证，两者结果一致。32例D5F3(Ventana + BenchMark)染色阳性病例中，29例样本100%肿瘤细胞阳性着色，3例部分(70%-90%)肿瘤细胞着色；24例样本阳性细胞呈现一致性的弥漫强表达，8例存在中-强度异质性染色(25%)。(图1-2，6)

2.3 4种不同抗体采用EnVision（Dako）手工IHC染色的结果 抗体D5F3（Ventana）、D5F3（Cell Signaling）、1A4/1H7、5A4(下文顺序均同)均使用EnVision（Dako）手工IHC检测60例NSCLC，28例ALK融合阴性样本均不着色。32例ALK融合NSCLC染色阳性表达依次为30例（93.8%，30/32）、27例84.4%（27/32）、30例93.8%（30/32）、18例56.3%（18/32），其中强阳性（3+）及中等阳性（2+）分别占65.6%、62.5%、68.8%、21.9%。4种抗体染色的特异性和阳性预测值均为100%，敏感性最高为93.8%，阴性预测值最高达93.3%。（表1，2；图3-5，7）

表1 4种抗体手工IHC方法检测60例NSCLC 的ALK蛋白表达

	D5F3 （Ventana）		D5F3（Cell Signaling）		1A4/1H7（OriGene）		5A4 （Abcam）
	融合+	融合-	融合+	融合-	融合+	融合-	融合+	融合-
IHC 3+	25%	0	25%	0	18.8%	0	9.4%	0
IHC 2+	40.6%	0	37.5%	0	50%	0	12.5%	0
IHC 1+	28.1 %	0	21.9%	0	5%	0	34.4%	0
IHC -	6.3%	100%	15.6%	100%	6.2%	100%	43.7%	100%
合 计	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%

表2 4种抗体EnVision 手工IHC染色比较

	D5F3 （Ventana）	D5F3（Cell Signaling）	1A4/1H7（OriGene）	5A4 （Abcam）
敏感性	93.8%	84.4%	93.8%	56.3%
特异性	100%	100%	100%	100%
阳性预测值	100%	100%	100%	100%
阴性预测值	93.3%	84.8%	93.3%	66.7%
2+及3+	65.6%	62.5%	68.8%	21.9%

2.4 4种不同抗体手工染色与全自动IHC法的比较 以D5F3（Ventana + BenchMark）染色结果为标准，4种抗体D5F3（Ventana）、D5F3（Cell Signaling）、1A4/1H7及5A4染色与其结果的一致性分别为96.7%、91.7%、96.7%、76.7%。4种抗体手工IHC着色的阳性细胞数量均下降（30%-100%），染色强度明显减弱，且着色异质性（弱-中-强度）增高（40.6%）。(图 1-8)

2.5 不同取材方式获得样本之间的染色比较 32例ALK阳性NSCLC中，20例为手术切除大样本，4种抗体手工IHC染色的敏感性分别为95%、95%、95%及65%，12例活检小样本的敏感性分别为91.7%、66.7%、91.7%及41.7%，前者高于后者。大样本的4种抗体染色中-强度（2+及3+）分别为75%、75%、90%、30%，小样本的分别为30%、40%、55%、25%，前者高于后者。另外，4例转移病灶（右锁骨淋巴结2例、额叶1例、顶叶1例）均弥漫一致强（3+）阳性表达4种抗体，与D5F3（Ventana + BenchMark）染色完全一致。

3 讨论

2007年Soda等^[6]首例报道肺腺癌患者的肿瘤组织中发现了EML4与ALK两个基因融合, 在NSCLC中，ALK最常见的融合形式是EML4-ALK，其他较为罕见的融合包括TFG-ALK、KIF5B-ALK以及KLC1-ALK等多种类型，不同的融合变体均具有恶性转化和致瘤性能力，使得组织表达融合蛋白ALK，检测出ALK状态也同样具有分子诊断和靶向治疗的临床意义^[7,8]。2013年美国病理协会、国际肺癌研究协会、分子病理协会出台《肺癌分子标志物检测指南》(以下简称《指南》)指出所有含腺癌成分的NSCLC均需检测ALK^[9]，《中国间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊断专家共识(2013版)》(以下简称《中国共识》)也强调对于潜在怀疑ALK基因融合变异的患者均进行ALK检测^[3]。在东亚裔人肺癌患者中，ALK基因变异仅3%-13%^[10]，如何更经济有效地让尽可能多的NSCLC患者接受ALK检测，对于个体化治疗的发展尤为重要。《指南》指出FISH是检测NSCLC中ALK状态的最精确手段，FISH检测对标本前处理、肿瘤数量和判读技术要求较高。与之相比，IHC操作易行、快速便宜、观察全面、判读简单。ALK阳性NSCLC中ALK蛋白水平较间变性大细胞淋巴瘤的含量低，之前的ALK抗体检测灵敏性太低^[11]，常规IHC方法无法用于临床筛查。目前《指南》推荐Ventana抗体D5F3和全自动IHC检测方法灵敏度高，为临床应用带来了巨大的突破，可应用于临床诊断。

本实验研究显示，抗体D5F3（Ventana）联合全自动免疫组化仪（BenchMark）检测ALK蛋白状态与FISH检测结果一致，再次验证D5F3（Ventana + BenchMark）检测的可靠。这种方法的优点在于引入OptiView DAB和信号扩增放大技术，提高了染色敏感性和着色强度，使结果判读容易准确，而且全自动染色仪染色也保证检测结果的标准化。但是昂贵的医疗设备（BenchMark）和耗材成本阻碍此技术在中小基层医院常规开展，在中国大陆仅少数病理科能用于临床筛查。而手工IHC不受染色仪限制、易于操作、医患费用低，更适合广泛普及。以D5F3（Ventana + BenchMark）检测结果为标准，4种抗体染色与其一致性高达76.7%-96.7%，阳性预测值100%，即便同一克隆的D5F3（Ventana）抗体，未采用全自动染色仪和信号扩增技术，手工IHC染色灵敏性和染色强度均下降。因此我们认为手工IHC染色只要肿瘤细胞胞浆着色，无论染色数量、强度（包括1+、2+、3+），可拟诊为ALK融合阳性，这与Selinger等的研究基本一致^{[5, 12]}，建议手工IHC染色可以作为初步筛查ALK蛋白状态的检测方法，当然还需要《指南》推荐的方法进一步验证。

目前已有多个实验室进行过IHC检测ALK蛋白的研究，Hutarew^[5]用D5F3(CellSignaling)手工IHC染色筛选出25例ALK阳性，其中3+、2+、1+表达分别占12%、48%和40%，与FISH检测阳性、阴性一致率为100%和96.2%。Conklin^[13]实验室采用同样的抗体和方法，其敏感性特异性为100%、75%。而Cabillic等^[14]选用5A4(Abcam)联合全自动免疫组化仪(BenchMark)检测1843例NSCLC，该抗体灵敏性仅为72%。以上结果及本实验数据都说明了选择敏感性高的抗体非常重要。随着新试剂的不断改进提高，手工IHC染色检测ALK已经越来越被临床接受，如LI^[15]和ZHOU^[4]等曾推荐抗体D5F3(Cell Signaling)联合手工IHC方法作为筛查ALK融合NSCLC的优选组合。本组实验比较4种不同抗体的染色情况，发现抗体1A4/1H7的灵敏性和着色强度（2+及3+）更优于其他3种抗体。1A4/1H7是美国OriGene公司最新投放市场的抗体，前期实验数据显示具有更高的灵敏度和特异性，着色明显、容易判读，可作为常规手工IHC筛查ALK融合NSCLC的最优选抗体之一。对于条件有限的中小医院，我们推荐先采用性价比高的抗体及手工IHC筛查ALK，对蛋白阳性病例再送至大医院进行FISH或D5F3（Ventana + BenchMark）IHC验证。而对于临床高度怀疑的阴性病例，如无/少量吸烟病史、EGFR/KRAS基因野生型、实体型为主型肺腺癌，也有必要进行分子检测。这种检测流程既惠及所有肺癌患者，又利于节省医疗资源，减轻患者经济负担，更保证个体化治疗的有效性。

HOUANG^[16]研究同一肺癌患者术前穿刺活检小样本与手术切除样本的ALK免疫组化检测结果相一致。而本组实验中活检小样本的阳性敏感性、染色强度都要低于手术切除大样本，原因可能在于小样本所含肿瘤细胞少和染色异质性，阳性细胞数量和3+着色的比率减少。另外，与标本前期固定和操作处理有关^[5,16]，《指南》建议使用10%中性福尔马林缓冲液固定活检小标本6-12小时，手术切除大标本固定8-18个小时^[9]。晚期患者往往无法手术而只能获得活检小标本，肿瘤细胞数量较少，并且FISH暗视野下难以区分非肿瘤细胞，常只有依靠IHC检测，病理医师则更应该谨慎对待活检小标本的操作和判读。本实验还观察到4例转移病灶均弥漫一致性强表达4种抗体，由于未获得对应原发病灶标本，无法比较ALK蛋白含量差异，有2例患者服用靶向药物克唑替尼，并且治疗有效。目前仅Ali^[17]报道一例肺原发腺癌与淋巴结转移癌均强阳性表达ALK蛋白，似乎都提示转移病灶也同水平表达ALK蛋白，这样对于晚期而无法进行原发肺部肿瘤活检的患者，临床更易取材活检。

中国肺癌发病率及病死率均是全世界最高的，个体化治疗任重而道远，ALK基因重排的诊断方法较多，根据实验条件选择最适宜的方法，保障患者的利益。本组实验只是单中心小样本量统计，随着更多临床数据的总结和技术的进步更新，常规手工IHC染色会逐步成为基层医院筛查ALK融合NSCLC的重要技术。

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图片说明:

图1 手术切除标本,抗体D5F3(Ventana)联合全自动免疫组化仪(BenchMark)及OptiView信号扩增放大技术显示肺腺癌表达ALK蛋白，着色范围异质性(左下 VS 右上)，左侧区域所有肿瘤细胞胞浆内弥漫一致棕褐色颗粒（3+），右侧区域部分肿瘤细胞着色。

图2 手术切除标本,肿瘤细胞呈现染色强度的异质性，癌细胞胞浆内见黄色或棕褐色(2+或3+)颗粒状着色(Ventana D5F3+ BenchMark + OptiView)

图3 手术切除标本,抗体1A4/1H7、D5F3(Ventana)分别采用常规手工IHC染色，均显示肿瘤细胞胞浆内弥漫的棕黄色(3+)颗粒状着色(EnVision,Dako)

图4 手术切除标本, D5F3(CellSignaling)采用手工IHC染色，显示肿瘤细胞胞浆内颗粒状黄色(2+)着色(EnVision,Dako)

图5 手术切除大标本, 5A4抗体手工IHC染色示肿瘤细胞胞浆内见淡黄色(1+)着色(EnVision,Dako)

图6 活检小标本,抗体D5F3(Ventana)全自动免疫组化仪染色，显示肿瘤细胞胞浆内见弥漫的颗粒状棕褐色(3+)着色(Ventana D5F3+ BenchMark + OptiView)

图7 活检小标本, 1A4/1H7、D5F3 (Ventana)采用手工IHC染色，显示肿瘤细胞胞浆内见黄色(2+)着色(EnVision,Dako)

图8 额部转移病灶，抗体1A4/1H7（OriGene）、D5F3 (Ventana)、D5F3(CellSignaling)、5A4(Abcam)分别手工IHC染色，均显示肿瘤细胞胞浆内弥漫一致的棕黄色-棕褐色(3+)颗粒状着色(EnVision,Dako)

注：本文摘自《临床与实验病理学杂志》2015年第3期

基金项目：国家自然科学基金（81171391,81372743）

作者单位：南方医科大学南京临床医学院/南京军区南京总院病理科，

南京 210002

作者介绍：沈勤，女，主治医师。E-mail:qinshen2005@163.com

周晓军，男，教授，通讯作者