用于蛋白质巯基亚硝基化修饰实时在体检测的荧光探针

蛋白质巯基亚硝基化修饰是生物体内一种重要的蛋白质翻译后修饰，也是一种典型的氧化还原依赖性细胞信号转导机制，是许多蛋白质发挥正常生物学功能的必要步骤。该修饰过程也是一氧化氮信号通路的一部分，其调控异常与多种心脑血管及神经退行性疾病的发生发展密切相关，发展对蛋白质巯基亚硝基化修饰的实时在体检测方法，对研究该转录后修饰所影响的生理病理学过程具有重要意义。

  传统检测蛋白质巯基亚硝基化的方法主要是生物素开关法，但这种方法样品处理过程复杂，对操作人员的技术水平有较高要求。更重要的是，由于蛋白质巯基亚硝基化修饰过程的可逆性及不同蛋白间转亚硝基化过程的存在，离体检测的结果可能存在较大误差。

为了实现蛋白质巯基亚硝基化修饰过程的实时检测，我们实验室根据RSNO基团可与三苯基磷类衍生物发生类Staudinger’s ligation的反应，设计了荧光探针PSNO。PSNO本身荧光较弱，但可在生理条件下与RSNO发生生物兼容性化学反应，生成具有强荧光的产物 (Fig 1)。

Fig. 1. Fluorogenic PSNO for insitu protein S-nitrosylation decetiction

分子水平的实验结果表明，探针PSNO具有相应快速、灵敏、选择性好的优点（Fig 2）。

A                                B

               

Fig. 2.(A) Fluorescentspectra overlay of PSNO before and after reaction with GSNO (10 μM). (B)Plot offluorescent response of PSNO (5 μM) versus the analyte (10 μM) at various time.

为了在活细胞水平验证探针PSNO检测蛋白质巯基亚硝基化修饰的可行性，我们在内皮细胞中过表达YFP标记的GAPDH蛋白验证。由于GAPDH蛋白的Cys152位易发生亚硝基化修饰，因此，过表达YFP-GAPDH的细胞在NO供体的存在情况下呈现出显著增强的胞内探针PSNO荧光；但若突变Cys152，胞内PSNO荧光将因为亚硝基化水平的降低而显著减弱。不仅如此，我们还发现，细胞经PEP-19或PTIO处理以清除NO后，胞内PSNO荧光也将显著降低，进一步说明探针的特异性(Fig 3)。

Fig.3.Characterization of GAPDHS-nitrosylation by PSNO in live HUVEC cells. HUVECs over-expressing WTGAPDH-YFP (1, 3) or GAPDH C152S-YFP (4) were treated without (1)or with (2, 3, 4) GSNO (250 μM)for 2 h before being stained with PSNO (10 μM) for 1 h. Formodulation of S-nitrosylation by clearance of intracellular NO or suppressing NO formation,cells were pretreated with PTIO (6) (150 μM, 24 h) prior to GSNO treatment, or co-transfected with PEP-19 (5) and WT GAPDH-YFP plasmid (5, 6) for 48–72 h, and then treated subsequently with GSNO (250 μM, 2 h) and PSNO (10 μM, 1 h). PI counterstainingindicates nuclear localization (red, λex 543 nm, λem 560−615 nm). PSNO fluorescence (blue) was collected at λex 405 nm and λem 420−480 nm. The YFPfluorescence (green) was collected at 525 nm with λex 515 nm. 

 基于上述结果，我们认为该探针可广泛应用于蛋白质巯基亚硝基化修饰研究中。目前文章已发表于：Biosensors andBioelectronics ,2017,94,162–168.