质谱技术在蛋白质组学研究领域的新进展:DIA和HRM

文献来源：Recent Advances in Mass Spectrometry: Data Independent Analysis and Hyper Reaction Monitoring. Expert Rev Proteomics. 2013; 10(6): 551-566.

最近，数据非依赖采集（data independent analysis，DIA）和超反应监测（Hyper Reaction Monitoring，HRM）在质谱分析领域崭露头角。这两种方法分别对传统shotgun分析的数据依赖采集方式（data-dependent analysis，DDA）和靶向蛋白质组学的选择性反应监测技术（selected reaction monitoring，SRM）进行了一定的改进。

DIA能够对复杂样品中的所有信号进行无偏向性的MS分析，从而获得更高的肽段覆盖率。HRM则能够在全高分辨子离子的水平上像SRM一样进行选择性靶向分析，以实现更高的分析特异性。这种新型的方法包括：MS^E、全离子碎裂(AIF, all-ion fragmentation)、傅里叶转换全反应监视（Fourier transform-all reaction monitoring）、pseudo-SRM (pSRM)、SWATH采集和平行反应监视（PRM , parallel reaction monitoring)等。虽然这些方法不会从根本上改变蛋白质组的研究模式，但是可以作为一个很好的补充研究工具。

本文主要对数据非依赖采集模式和平行反应监测方法的优点和存在的问题进行探讨及分析。

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以发现为目的的shotgun蛋白质组学一般采用数据依赖型（DDA）的采集方式。在该过程中，一级质谱首先进行一次全扫描，其后强度满足一定预设值的肽段离子被随机地选择、分离并进行二级碎裂测序。在母离子选择的过程中，质谱更偏向于扫描高丰度的肽段。其他额外的选择原则包括动态排除、电荷选择、背景扣除等等，以此避免对干扰信号的正离子的采集。

在靶向蛋白质组的分析中，选择性反应监测（SRM），也被称为多反应监测（MRM），被用于选择性监测一定数量的能够指针目标蛋白的母离子/子离子对。SRM离子对的选择通常是基于先前采集的子离子扫描数据计算、公共数据库或根据理论的酶切规则预测而获得。SRM离子对信号会进一步促发一个子离子扫描，该过程通常是在一个四极杆线性离子阱（Q-TRAP）或其他能够进行快速扫描的串联四极杆质谱中完成，以便提供一个可靠的子离子图谱。通过参与已知浓度的合成的同位素肽段作为定量内标，SRM还可以进行蛋白质绝对定量分析。虽然SRM具有选择性高、重复性好、线性范围宽等优势，但是在实际应用中，复杂样品中能够进行常规SRM监测的蛋白数量还是较少（最多100个），而且还需要进行复杂耗时的研发以及方法优化过程。

另外，在SRM分析过程中，即使所有预测的SRM离子对都被检测到，通过色谱峰比对的方式也不能完全确认目标肽段。这是因为干扰信号的分子量可能会落在四极杆的精度范围内，导致定性的假阳性。另一方面，即使通过MIDAS的方式获得了序列信息，对于肽段鉴定的可信度来说子离子图谱也常常是低质量的（低分子量分辨率/精度或高干扰）。这些数据需要通过相对昂贵的参照品或同位素标准品肽段来进一步验证。对于低丰度蛋白的分析来说，需要开发灵敏度、动态范围更高的SRM方法。

然而，靶向蛋白质组学的状况将会得到改变。一个主要的驱动力就是，基于质谱的蛋白质组学分析正处于从大范围地发现型分析到更强调假说驱动型分析的转化阶段，迫切需要精确性、准确度和动态范围更广的靶向组学分析技术。例如，近几年来通过shotgun分析发现的大量候选生物标志物并没有进行随后的有效验证。虽然可以采用基于抗体的western blot或ELISA方法，但往往多数蛋白无法获得可以应用的抗体。很多商业化的抗体不足够有效，而且耗费往往巨大。对于大量的潜在标志物的分析需求，多目标的靶向蛋白质组学方法会比传统方法耗费更少的时间和分析成本。但是由于技术上的限制和难度，SRM并没有将该目标变为现实。最近适于进行DIA和HRM的高分辨、高精度系统的质谱方法和仪器的进展则提供了推动力。这些强有力的方法能够实现从原文件中抽提或重建与SRM类似的离子图谱或的同时，获得肽段序列鉴定信息。这些新技术能够同时提供复杂样品中复杂蛋白的定性和定量信息。

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数据非依赖和靶向采集分析的概述

DIA和HRM采用TOF、Orbitrap或其他高分辨率质谱分析器组成的整合系统进行全扫描。这些方法的主要差别在于第一阶段离子分选时采用的母离子检测窗口的宽度，其决定了传输、碎裂和测序的离子范围。母离子分选窗口的范围可从全分子量范围（通常是400–2000 Th）到较宽的10–100 Th至较窄的0.4–4 Th。DIA的方法采用较宽的分选窗口，其造成的结果就是能够产生非常复杂的数据结构，以及需要连贯的、错综复杂的数据处理。反之，较窄的分选窗口有利于进行高选择性地分析，如HRM方法。其数据随后能够按照预定的方法进行重建，如果是通过基于三重四级杆的SRM所采集的数据。Table 1对基于不同仪器的各种选择性分析方法的优缺点，以及其对蛋白质组学分析的影响进行了总结。

本文主要介绍其中的DIA（ Data-independent Acquisition）和平行反应监测（parallel reaction monitoring，PRM)。

Table1. A summary of selected emerging data-independent analysis/HSM approaches and their respective pros and cons

AIF: All-ion fragmentation; DDA: Data-dependent acquisition; DIA: Data-independent analysis; HCD: Higher energy collisional dissociation; IDENTITY: Ion Accounting algorithm; MRM: Multiple reaction monitoring; MS: Mass spectroscopy; PRM: Parallel reaction monitoring; pSRM: Pseudo-SRM; Q-TOF; Quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight; UPLC: Ultra-performance liquid chromatography.

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下期预告：基于orbitrap的DIA技术介绍

SWATH和PRM介绍

技术展望

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